江苏化工机械网

当前的位置是:主页 >> 化工机械厂家

MALDITOFMS已进临床微生物实验室或成细菌鉴定领域主力军

时间:2022-12-02 来源网站:江苏化工机械网

随着科技的不断进步、相信在不久的将来,MALDI-TOF MS必将成为细菌鉴定领域的“主力军”。

随着技术的不断成熟和广泛使用,其在微生物检验常规诊断中的作用越来越受到关注,基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术( MALDI-TOF MS)已经进入临床微生物实验室。

自20世纪80年代起,质谱技术就已经成为科学研究中用于蛋白分析的强大工具。随着技术的不断成熟和广泛使用,其在微生物检验常规诊断中的作用越来越受到关注,基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术(matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)已经进入临床微生物实验室用于病原菌鉴定,与传统的表型鉴定及分子生物学技术相比,MALDI-TOF MS快速、准确、成本低廉,且数据库可不断更新完善,极大地提高了临床微生物尤其是微需氧菌、厌氧菌、分枝杆菌及真菌等难培养微生物的鉴定效率,尽管该技术推向临床不到10年,现已被公认为微生物快速鉴定的里程碑。

MALDI-TOF MS基本原理

MALDI-TOF MS 的离子源通过激光轰击待测样品与基质形成的共结晶薄膜,使基质从中吸收能量并传递给生物分子,二者间发生质子( 即电荷) 转移而使生物分子电离。电离的生物分子在电场作用下加速通过飞行管道,根据到达检测器的时间及离子的数量得到质/荷( m/z) 比值及信号值而形成相应的峰图。

微生物由其自身独特的蛋白质组成,通过比对MALDI-TOF MS 获得种属间的特异峰图( 主要由核糖体蛋白形成,m/z 范围为2000——20000) 与数据库中的参考谱图,根据同源性距离得到最接近的菌种并给出相应的鉴定分值,再依据实际情况分析,可得到最终的鉴定结果。值得一提的是,MALDI与其他电离方式相比具有很多优势,其电离方式为“软电离”——整个分子在离子化过程中都能够保持完整,得出的质谱图就会让不同大小的分子有序排布,这样就便于我们对谱图进行分析。而其他电离方式更加激烈一些,会导致分子碎裂,最后得出的谱图会产生很大干扰,造成分析困难。

MALDI-TOF MS的应用领域

1.临床病原微生物

MALDI-TOF MS 不但可用于分纯菌落,也可用于某些特定临床标本的直接检测,包括阳性血培养液、中段尿、脑脊液等样本中微生物的鉴定。该技术也可用于临床病毒感染的诊断、病毒基因分型和流行病学研究。

2.食源性微生物

该技术在饮用水被污染的早期就能直接鉴定出病原菌,已成功用于食品微生物的检测,并建立了食源性致病菌蛋白质指纹图谱数据库。

3.环境微生物

MALDI-TOF MS 在环境微生物的鉴定中也日益受到重视,例如海洋、大气、土壤等特定环境中的潜在致病微生物。以上栖息地的微生物种类繁多,MALDI-TOF MS 在准确鉴定微生物的同时,将来自不同环境和地域的同一种微生物通过MALDI Biotyper 软件的聚类分析功能进行溯源。目前已经初步建立了环境微生物数据库。

4. 其他领域

MALDI-TOF MS 在新的生物学标志物筛选、新生儿遗传代谢病临床应用中也具有很好的应用前景,有可能成为个体化医疗中快速精准的检测技术。例如先天性甲状腺功能减退症、苯丙酮尿症、囊胞性纤维症、半乳糖血症、氧化脂肪酸缺陷症、有机酸尿症和尿素循环缺陷症等。

MALDI-TOF MS数据库现状

目前主要有4 种MALDI-TOF MS 系统: MALDI Biotyper系统( Bruker Daltonics,德国);VITEK MS 系统( BioMérieux,Marcy l'Etoile,法国);the AXIMA @ SARAMIS 数据库( AnagnosTec,德国) 和the Andromas( Andromas,法国)。而可购买到的数据库有3 种: MALDI Biotyper 数据库( 布鲁克道尔顿,德国) ,Saramis( BioMérieux,用于来自Shimadzu 的质谱设备) 和Andromas ( 可与布鲁克道尔顿或Shimadzu 硬件兼容)。其中MALDI Biotyper 和VITEK MS 系统已获得中国食品和药品监督管理局的许可证,可用于临床样本的检测。MALDI Biotyper 和VITEK MS 系统对应的临床微生物基础数据库分别为Biotyper 2.0 database 和Vitek MS plus Saramis Knowledge base 2.0。Biotyper 2.0 database中包含的菌种丰富,但缺乏志贺菌( 与大肠埃希菌亲缘性过近,常规比对算法无法区分) ,且分枝杆菌、丝状真菌、布鲁氏菌以及霍乱弧菌等所在数据库需单独购买; Vitek MS plus Saramis Knowledge base2.0 中包含的菌种少于Biotyper 2.0 database,但拥有霍乱弧菌的数据。

对于其中缺少的菌种,我们除了通过购买其他数据库获得,还可通过自建数据库来加以完善,那么该如何进行自建呢?

(1) 通过生化反应或基因测序鉴定并确认待入库菌的种名;

(2) 分纯单菌落以获得足量单克隆株;

(3) 样本制备: 根据待入库菌蛋白质提取难度及日后鉴定的需要,灵活选用前处理方法;

(4) 自动或手动采集质谱谱图;

(5) 谱图评估筛选: 选择20 —— 24 张质量较好的谱图,减小偶然误差;

(6) 操作软件完成建库。

MALDI-TOF MS 数据库扩展完善的重要性

数据库是MALDI-TOF MS 的核心,待检测微生物只有在数据库里有相应的质谱图才可能被鉴定。数据库不仅要包含微生物所有的属,也应包括种,甚至株。质谱数据库完善意义重大,具体原因如下:

1.分类词目不断增加,新物种不断被发现。有时待测微生物未能被鉴定出来是因为它是新的物种或分类。比如过氧化物酶阴性的革兰阳性球菌有许多新种类,而且其分类也在不断发展。只有制造商或者用户把新发现的物种添加到数据库,按照物种分类词目的变化去完善数据库,才能保证新物种的准确鉴定。

2.有一些物种遗传背景很相近,亲缘性高,增加了鉴别的难度。现在还不清楚是否可以通过优化数据库或者软件使一些同源性高度相近的微生物的鉴别成为可能,但像这样的细节如果不被考虑,就会造成鉴定错误。

3.微生物标本有可能来自不同地域,不同分离基物,有不同分离年限,而且不同地域的优势菌不同,数据库中微生物单一的参考质谱图有时并不能代表分离自其他微生物实验室的同种典型菌株。所以数据库中应包含同一个菌种采集的多个分离株的指纹质谱图,用户可以将分离的本地典型菌株作为参考菌株填充到自定义数据库中,必要时可考虑对某些微生物建立本地数据库,甚至可以建立多地区数据库联共享。

4.分枝杆菌、厌氧菌等疑难鉴定微生物,其数据库的建立和完善更为必要。

5.商业数据库中对环境微生物的指纹图谱很少。由于MALDI-TOF MS 越来越多用于鉴定环境微生物,因此构建环境微生物的质谱数据库是新的研究方向。很多研究也表明,质谱数据库的扩大可以使鉴定正确率大大提高。例如分枝杆菌在数据库扩展前后的鉴定正确率分别79.3%和94.9%。因此数据库的更新和完善是运用MALDI-TOF MS 技术正确鉴定微生物的基础。

MALDI-TOF MS未来展望

MALDI-TOF MS在不久的将来肯定会取代传统的生化鉴定法,在实验室大力推广。在西欧,MALDI-TOF MS已经在临床实验室使用,目前FDA和美国抗生素委员会也正在讨论将这一方法在临床推广,这也将带来细菌鉴定及耐药性检测的革命。

目前,MALDI-TOF MS仍存在不少问题值得继续研究改进,比如不同的培养基、培养时间、上样方式等因素影响实验的重复性、数据库尚不完善、从原始标本中直接进行检测涉及到的最低细菌量以及感染性标本的防护、或是在同一标本中分离出多种进化程度相近的物种则会难以辨别等等。但是另一方面,由于该项技术具备快速、灵敏、准确、经济、分辨率高、对原始样本要求低等优点,令其在临床微生物领域具有很大的发展前景。随着科技的不断进步、相信在不久的将来,MALDI-TOF MS必将成为细菌鉴定领域的“主力军”。

客厅装修

厨房装修

旧家翻新装修公司